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西宁实时荧光定量PCR的原理及应用

发布日期:2021-4-25 9:39:00来源:http://xn.sxyksw.com/news600214.html

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陕西依科生物技术服务有限公司是一家专业提供病理诊断服务的独立医学检验所,主要包括西宁病理技术服务、西宁HE染色、西宁石蜡包埋、病理切片扫描等,其中以分子病理为基础的精准服务是本公司特色、以数字病理为纽带的多学科综合诊疗服务是本公司的优势。

实时荧光定量PCR 可根据荧光染料的不同分为染料法和 TaqMan探针法两种;而根据数据分析方式又可以分为相对定量和绝对定量。这些不同的实验方法有不同的原理及应用。

1 SYBR-Green染料法:指在PCR反应体系中,加入荧光染料(SYBR-Green最为常用),进而监测荧光变化的实验方法。荧光染料SYBR-Green在游离状态不发射荧光。而在SYBR非特异性地掺入DNA双链后则发射荧光信号。从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。SYBR-Green仅与双链DNA进行结合,因此可以通过溶解曲线,确定PCR反应是否特异。

SYBR-Green染料法的优势在于方便快捷,无需探针故成本较低,但是对引物特异性要求较高,检测灵敏度相对较低。其结果多用于进行相对定量分析。

2 TaqMan探针法:PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

Taq-Man探针法的优势在于特异性较高,重复性好,但是探针只能针对一个特定序列,且探针价格较高。这种技术可以用于检测基因突变检测进而进行遗传病筛查,癌症诊断及药物靶点筛选。结果多用于绝对定量。

1相对定量

分析特定样品相对于参考样品某个基因表达量的变化。主要在科研中使用,测量基因表达对各种处理(加药、造模、基因过表达、RNA干扰等)的应答。

2绝对定量

使用标准样品制作标准回归曲线,利用线性回归的方法进行绝对定量时,可以基于已知数量对未知数量进行定量。主要在临床检测中使用,将病毒拷贝数与疾病状态建立关联。并进行基因突变检测(可用于转基因食品检测、遗传病筛查、癌症早期诊断、靶向药靶点筛选)。


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